PHƯƠNG PHÁP THU VÀ XỬ LÝ MẪU TRONG THỦY SẢN

I. Giới thiệu
     Có lẽ yêu cầu trọng nhất trong nghiên cứu về sinh học các là phải thu được số mẫu lớn và có tính đại diện. Ngoài việc chọn lựa vị trí (địa điểm) thu mẫu phù hợp thì cần phải thu được số mẫu đủ lớn để kết quả phân tích phản ánh chính xác nội dung nghiên cứu mong muốn. Có nhiều cách để thu được mẫu và loại mẫu thu cũng phải tùy thuộc vào nội dung của nghiên cứu, ví dụ thu mẫu để xác định giống loài, thành phần loài hay là thu để đánh giá trữ lượng,... Có những nội dung nghiên cứu đòi hỏi người thu mẫu phải có công cụ đánh bắt riêng, nhưng có nội dung có thể dựa vào thu mẫu từ ngư dân, trao đổi để ghi nhận thông tin từ ngư dân, thu từ chợ hay từ những người có liên quan khác ở địa bàn nghiên cứu. Tuy nhiên, trong thực tế thì việc thu thập các thông tin qua ngư dân không phải lúc nào cũng đầy đủ hoặc nhận được các trả lời chính xác hoàn toàn, bởi lẽ ngư dân không có ghi chép các thông tin, hoặc đôi lúc vì một lý do nào đó mà họ không thể nói thật hết những điều họ làm hay biết. Trong trường hợp nầy, người thu mẫu phải tạo ra một sự thân thiện nhất định và biết cách trao đổi để có thể khai thác được thông tin chính xác nhất về mẫu thu của mình.

     Bên cạnh đó, không phải lúc nào các mẫu thu đều có thể xử lý (phân tích) ngay tại chỗ mà phải mang về phòng thí nghiệm để phân tích. Vì thế, vấn đề xử lý mẫu thu cũng đòi hỏi phải được thực hiện nghiêm túc và khoa học để có thể có được kết quả phân tích chính xác. Phương pháp xử lý vào bảo quản mẫu vì thế tuỳ thuộc vào từng nội dung nghiên cứu.

II. Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu

   1. Nguyên tắc trong thu mẫu

     

      a) Định danh chính xác mẫu thu

     Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong nghiên cứu sinh học cá là phải xác định chính xác loài cá nghiên cứu. Nhưng đây không phải là công việc dễ dàng, nhất là khi mẫu thu là các loại cá trong giai đoạn con non. Thỉnh thoảng người nghiên cứu không phân biệt được 2 loài có quan hệ gần nhau và gọi chúng với cùng một tên loài. Tùy theo địa phương, mỗi loài cá có thể có những tên gọi khác nhau, cho nên việc sử dụng tên khoa học của loài là thuận tiện và chính xác nhất.

     Định danh loài thường được tiến hành bằng cách xác định một loạt các đặc điểm hình thái bao gồm: (i) mô tả hình thái của loài như hình dạng cơ thể, các loại vi, vị trí miệng, kiểu vẩy,... (ii) Các chỉ tiêu số lượng (thí dụ công thức vi) như số lượng tia vi, vẩy, đốt sống. Số lượng gai và tia vi thường là một chỉ số không đổi giữa các cá thể trong cùng 1 loài, vì vậy công thức vi là một công cụ quan trọng để định danh loài. Ngoài công thức vi, số lượng vẩy, công thức răng hầu, số tia mang, số đốt sống cũng là các chỉ tiêu số lượng quan trọng để định danh loài. (iii) Các số đo hình thái như chiều dài đầu, cao thân, ... mối tương quan của các chỉ số này với chiều dài tổng cộng hay chiều dài chuẩn. Các số đo này thường được biểu hiện bằng tỉ lệ hay phần trăm.

     b) Chọn địa điểm thu mẫu

     Mẫu thu dùng cho nghiên cứu sinh học cá có thể thu ở chợ, cảng cá hay trực tiếp đánh bắt bằng các dụng cụ chuyên dùng (lưới kéo, lưới cào, chài,...). Tuy nhiên, vị trí thu mẫu là yếu tố quyết định đến kết quả của nghiên cứu. Thông thường, thu mẫu ở các cảng cá phù hợp hơn việc thu ở chợ, bởi lẽ đó là nơi mà mẫu thu thể hiện tính đại diện cho ngư trường mà họ khai thác như biển, sông, hồ chứa,.... Bên cạnh đó, việc thu mẫu ở các cảng cá cũng sẽ rất quí cho việc tính toán sản lượng khai thác vì nó phản ánh chính xác nhất lượng cá khai thác theo ngư trường hay theo ngư cụ khai thác.

Vị trí thu mẫu bằng cách đánh bắt trực tiếp có ý nghĩa rất quan trọng trong việc xác định vùng phân bố, tập tính di cư, bãi đẻ, tập tính sinh sản,... Các yếu tố môi trường nơi thu mẫu đôi khi cũng cần phải được xác định như độ vẫn đục, độ mặn, pH, mật độ phiêu sinh vật... để có kết luận chính xác hơn về tập tính dinh dưỡng, các thích nghi sinh lý, vòng đời của đối tượng nghiên cứu.

     c) Chuẩn bị biểu mẫu

    Khi thực hiện công tác thu mẫu thường phải chuẩn bị các biểu mẫu để có thể ghi chép một số thông tin về mẫu thu và cũng có thể xác định một số chỉ tiêu đo đạt nhanh. Thông thường, mẫu thu phải có ghi đầy đủ các thông tin như:

       1. Nơi khai thác (tên sông, hồ, ngư trường,...)

       2. Địa điểm thu mẫu

       3. Loại tàu khai thác

       4. Ngư cụ khai thác và kích thước mắc lưới

       5. Độ sâu ngư trường khai thác

       6. Diện tích khai thác (nếu được)

       7. Loài khai thác, tỉ lệ thành phần loài,....

    

    Nếu cần có thể ghi nhận nhanh kích cỡ về chiều dài và trọng lượng của cá tại nơi thu mẫu. Thông thường thì có thể phân nhóm theo kích cỡ cá để đo đạt, trong trường hợp cá có kích thước lớn hơn 30 cm chiều dài thì có thể đo độ chính xác là 1 cm, cá kích cỡ nhỏ hơn 30 cm thì độ chính xác là 0,5 cm và đối với cá nhỏ có thể đo ở độ chính xác 1 mm (Holden và Rait 1974).

   2. Thu mẫu phân tích ở phòng thí nghiệm

     

     Thu mẫu cho các phân tích ở phòng thí nghiệm yêu cầu phải có tính đại diện cho quần thể. Mẫu thu cần phải được giữ càng tươi càng tốt. Tùy theo yêu cầu mà mẫu thu cũng có thể khác nhau, nếu như thu mẫu cho nghiên cứu mô học phải là mẫu sống thì thu mẫu phân tích tính ăn của cá phải thu vào buổi sáng (5:00-7:00 giờ) để không bị ảnh hưởng bởi chu kỳ ăn trong ngày (diurnal rhythm) và khả năng tiêu hóa thức ăn của cá. Theo Robotham (1977) đối với mẫu phân tích dinh dưỡng thì sau khi thu phải cho ngay vào dung dịch Chloral hydrate 10%, sau khi gây mê (narcotization) thì cố định trong formol trung tính 40% và sau đó pha loãng còn 5% để bảo quản lâu dài. Với cách nầy ông cho rằng sẽ giữa được tốt các thành phần trong dạy dày và ngăn cản sự biến mất một số thành phần.

     

     Hầu hết các nghiên cứu về sinh học cá được tiến hành trên một số ít mẫu thu được từ một quần thể có số lượng lớn. Khái niệm quần thể ở đây là tất cả các cá thể thuộc một loài và đang sống ở một khu vực địa lý nhất định, quần thể cũng có thể được xem như một nhóm các cá thể thuộc loài đang được nghiên cứu (Moller, 1979). Toàn bộ quần thể thì quá lớn cho nghiên cứu, hơn nữa cũng không thể tiến hành các phân tích trên tất cả các cá thể đánh bắt được. Vì vậy, việc chọn mẫu đại diện là cần thiết cho các nghiên cứu sinh học. Có nhiều cách để thu mẫu, tuy nhiên có thể chia ra thành 2 phương pháp chính là (i) thu mẫu ngẫu nhiên (random sampling) và (ii) thu mẫu có chọn lọc (non-random sampling). Tuy nhiên phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên được áp dụng nhiều nhất, trong phương pháp này tất cả các mẫu trong quần thể đều có khả năng được chọn lựa bằng nhau.

     

     Phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên lại được chia là 2 phương pháp là (i) thu mẫu hoàn toàn ngẫu nhiên (simple random) và (ii) thu mẫu ngẫu nhiên có giới hạn (restricted random). Trong phương pháp thu mẫu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi cá thể trong quần thể sẽ được gán cho một số (gọi là số ngẫu nhiên – random numbers) khi đó những cá thể nào được thu làm mẫu sẽ được xác định bằng các bảng số ngẫu nhiên (random table). Phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên có giới hạn lại có 2 cách thu mẫu: (i) thu mẫu phân tầng (stratified sampling) đối với quần thể không đồng nhất, khi đó quần thể sẽ được chia thành các phần đồng nhất và mẫu sẽ được thu độc lập từ các phần đồng nhất đó; và (ii) thu mẫu nhiều giai đoạn (multi-stagesampling), khi quần thể quá lớn (thậm chí số lượng rất lớn cho một mẫu đại diện) khi đó việc thu mẫu được chia thành 2 giai đoạn. Trước tiên quần thể muốn thu mẫu được chia thành các quần thể đại diện (sub-population) và mẫu sẽ được thu từ các quần thể đại diện (mẫu cấp 1). Bước tiếp theo, từ các mẫu thu của các quần thể đại diện, tiến hành thu các mẫu đại diện (mẫu cấp 2). Mẫu cấp 2 có thể được thu nhiều hơn 2 giai đoạn tùy thuộc vào nghiên cứu và kích cỡ của quần thể, do vậy phương pháp này được gọi là phương pháp thu mẫu nhiều giai đoạn.

     

     Vấn đề quan trọng nhất của việc thu mẫu là xác định số lượng mẫu thu. Có nhiều ý kiến cho rằng số lượng mẫu nên dao động từ 1-25% kích cỡ quần thể. Khi số lượng mẫu quá nhỏ có thể sẽ không đại diện được cho toàn bộ quần thể, trái lại số lượng mẫu quá lớn sẽ tốn rất nhiều thời gian để phân tích và làm gia tăng chi phí. Số lượng mẫu thu cũng phụ thuộc vào từng nghiên cứu, tuy nhiên số lượng từ 80-100 mẫu với các kích cỡ khác nhau cho mỗi tháng là thích hợp cho các nghiên cứu thông thường về sinh học cá.

   3. Kỹ thuật bảo quản mẫu

     Yêu cầu mẫu cho nghiên cứu sinh học phải còn tốt, những mẫu hư sẽ rất khó cho các phân tích vì thế mẫu cần được bảo quản càng nhanh càng tốt. Mẫu sau khi thu cần được rửa ngay bằng nước ngọt để mẫu được sạch đồng thời loại bỏ các vi sinh vật có thể bám theo mẫu, nhất là mẫu thu từ ngư dân. Mẫu sau khi rửa sạch thì cần đánh dấu và cân trọng lượng và chiều dài, và tất nhiên chi tiết của mẫu cần được ghi chép cẩn thận trong sổ. Đối với các mẫu cá có kích cỡ lớn rất cần thiết phải gắn các thẻ hay phiếu có ghi các chi tiết như nơi đánh bắt, chiều dài, trọng lượng và giới tính. Mẫu không ghi rõ sẽ khó sử dụng trong nghiên cứu.

     

     Mẫu thu có thể cố định ngay trong dung dịch formol. Mẫu dùng cho phân tích dạ dày cần phải được cố định ngay sau khi thu. Dung dịch cố định mẫu thường dùng là formol 10% (1 phần formol và 9 phần nước) cho những mẫu có kích thước lớn (lớn hơn 15 cm) và 5% cho các mẫu có kích thước nhỏ. Dung dịch được dùng cho cố định mẫu phải là dung dịch trung tính, thông thường borax sẽ được thêm vào trong formol (1:1000).

     Phần bụng của mẫu cá có kích thước lớn nên được mổ và cắt sâu vào trong cơ hai bên thân cá để dung dịch cố định có thể thấm vào bên trong. Những cá nhỏ hơn 15 cm dài chỉ cần mổ phần dụng cá là đủ. Mẫu cá thường được cố định khoảng 7-10 ngày, sau đó rửa sạch và cố định lại trong dung dịch formol 10% hay cồn 70% (ethyl alcohol). Nếu như giữa mẫu trong dung dịch cồn thì trước tiên nên giữ trong cồn 50% từ 5-7 ngày trước khi chuyển sang cồn 70%. Trong trường hợp muốn giữa mẫu lâu, nếu dùng formol thì phải thay hàng tháng còn nếu giữa trong cồn (alcohol) thì thay mỗi 3 tháng. Tuy nhiên, tùy từng cơ quan của cá mà cách bảo quản mẫu có thể khác nhau để có thể giúp cho quá trình phân tích mẫu đạt kết quả tốt nhất. 

     Vảy, đá tai, gai vi lưng hay gai vi ngực thường được sử dụng để xác định tuổi cá. Vảy cá thường được thu từ 5-10 vảy cho mỗi cá thể. Thông thường vảy tròn (cycloid scale) được lấy ở vùng giữa của vi lưng và đường bên, trong khi vảy lược (ctenoid scale) được thu ở vùng vi ngực. Trước khi thu vảy, mẫu cần phải được rửa sạch để loại bỏ các vảy dính trên thân cá (các vảy này có thể là của các mẫu cá khác dính vào), và chỉ thu các vảy còn đính chặt vào thân cá. Cũng có thể dễ dàng nhận biết các vảy tái sinh do sự sắp xếp không theo trật tự và thiếu các vòng đồng tâm gần, các vảy này không nên thu mẫu. Nên chọn thu đủ số lượng mẫu với các vảy đồng dạng. Khi lấy vảy cần cẩn thận tránh làm tổn hại phần rìa của vảy. Mẫu vảy của mỗi cá thể có thể được chứa riêng trong các túi (giấy hay nilon) có dán nhãn với đầy đủ các thông tin về mẫu.

     

     Mặt cắt thẳng đứng của đá tai cũng được sử dụng để xác định tuổi của cá. Đá tai thì nằm trong một khe của tai trong. Cách thu đá tai dễ dàng nhất là thu qua một đường mở nằm ngang trên đầu phía sau mắt, hoặc mở nắp hộp sọ. Một phương pháp khác để thu đá tai mà vẫn giữ nguyên hình dạng mẫu vật là lấy từ phần vòm miệng, tuy nhiên phương pháp này khó thực hiện hơn. Trước khi cắt mẫu, đá tai phải được đúc thành khối trong polyester hay nhựa thông. Có thể bảo quản đá tai bằng các phương pháp sau:

    -  Giữ trong dung dịch glycerin và nước theo tỉ lệ 1:1.

    -  Giữ đá tai trong creosol hay terpineol (Gibson và Ezzi, 1978).

    -  Ngâm trong dung dịch 1% potassium hydroxide (KOH) để loại trừ hết các mô liên kết sau đó làm khô và giữ trọng lọ kín (Strum, 1978)

     Gai cứng của vi lưng (hoặc vi ngực) cũng được sử dụng để xác định tuổi cá. Gai vi được cố định trong dung dịch formal-calcium ít nhất 24 giờ. Cách chuẩn bị dung dịch này như sau:

       40% formaldehyde 10 mL

       Calcium chloride khan 10 g

       Nước cất 80 mL

       Bột CaCO3 thêm vào quá mức bão hòa

     Sau khi cố định, mẫu được rửa sạch bằng nước cất và chuyển vào dung dịch khử canxi trong thời gian từ 6-12 giờ tùy thuộc vào chiều dài của gai vi. Dung dịch khử canxi được chuẩn bị bằng cách trộn lẫn 2 loại dung dịch A và B (Perry, 1967). Dung dịch A gồm 50 g sodium citrate và 250 mL nước cất, dung dịch B gồm 125

mL acid formir và 125 mL nước cất. 

    Các phần khác của bộ xương như xương nắp mang, cột sống, xương gốc vi đuôi, ... có thể được thu bằng cách đun mẫu trong nước sôi khoảng 5 phút, khi đó các cơ bám vào xương sẽ dễ dàng tách ra. Mẫu xương được làm khô ở nhiệt độ phòng trong thời gian khoảng 24 giờ. Sau đó giữ mẫu trong các túi có dán nhãn với các thông tin về mẫu cá.

     

     Cố định tuyến sinh dục đúng phương pháp là khâu rất quan trọng cho các nghiên cứu về sinh học sinh sản. Theo Gibson và Ezzi (1978) thì sau khi thu mẫu tinh sào cần phải đo chiều dài (tính bằng mm), cân trọng lượng và cho vào cố định trong cồn 70%. Buồng trứng sau khi thu cũng cần phải cân và đo sau đó xẻ dọc để cho dung dịch cố định thấm vào. Để cố định trứng thì Simpson (1951) đề nghị dùng dung dịch “Gilson’s fluid”. Dung dịch này không những có tác dụng cố định trứng mà còn giúp phá vỡ các mô liên kết trong buồng trứng và làm tách rời trứng. Để tách rời trứng khỏi các mô liên kết có thể cần giữ mẫu vài tuần trong dung dịch Gilson, lắc nhẹ lọ chứa trứng đến khi thấy hầu hết các trứng tách ra khỏi các mô của buồng trứng. Loại bỏ các mô của buồng trứng và nếu như trứng còn dính nhau thì tiếp tục giữ trong dung dịch cố định. Trứng đã tách rời phải được rửa sạch bằng cồn tuyệt đối và sau đó bảo quản trong cồn tuyệt đối cho các phân tích về sau (đo và đếm số trứng). Cách chuẩn bị dung dịch “Gilson’s fluid” như sau:

       100 ml cồn 60%

       15 ml a-xít nitric 80%

       18 ml a-xít glacial acetic

       20 g mercuric chloride

       880 ml nước cất

     Ngoài ra, việc bảo quản trứng còn có thể thực hiện trong dung dịch formol-saline theo đề nghị của Hancock (1979). Dung dịch này có thể chuẩn bị bằng cách pha 100 ml formol 40% với 900 ml nước cất và bổ sung thêm 100 g muối (sodium chloride). Buồng trứng trước khi cố định phải sẽ dọc để dung dịch cố định thấm vào, và buồng trứng cần được xáo trộn (shaking) mỗi 2-3 tuần trong vòng 5-6 tháng để trứng tách rời ra khỏi các mô cơ liên kết. Dung dịch cố định cần được thay định kỳ đến khi mẫu trứng được đem ra phân tích.

   4. Kỹ thuật cố định mẫu cho các nghiên cứu mô học

     Đây là kỹ thuật rất cần thiết cho các nghiên cứu mô học trên các cơ quan khác nhau của cá. Ống tiêu hóa và tuyến sinh dục là 2 cơ quan được nghiên cứu phổ biến nhất vì sự khác biệt về tổ chức mô của 2 cơ quan này sẽ giúp người nghiên cứu hiểu biết hơn về sự phát triển, tập tính dinh dưỡng và giai đoạn thành thục sinh dục của từng loài cá. Kỹ thuật này cũng rất cần thiết cho các nghiên cứu về bệnh trên các loài thủy sản. 

   

     Mẫu thu cho các nghiên cứu mô học phải là mẫu tươi được lấy từ cá mới được giết chết hay cá được gây mê. Tùy loại mô và kích thước mẫu mà có các loại dung dịch cố định và thời gian cố định mẫu khác nhau. Với các nghiên cứu về ống tiêu hóa, mẫu ống tiêu hóa của cá trưởng thành có thể được cố định bằng dung dịch Bouin trong thời gian 12 giờ sau đó chuyển sang bảo quản trong cồn 70%, với cá bột hay cá hương thì có thể cố định bằng dung dịch formol trung tính 10%. Đối với mẫu buồng trứng thì cố định bằng dung dịch Bouin ít nhất 24 giờ sau đó chuyển sang bảo quản trong cồn 70%. Mẫu cố định bằng dung dịch Bouin, khi bảo quản trong cồn 70% cần thay cồn nhiều lần cho đến khi màu vàng của dung dịch bảo quản được loại bỏ. Một loại dung dịch cố định cũng thường được sử dụng (nhất là trong các nghiên cứu mô học trên tôm) là dung dịch AFA (alcohol – formalin – acid acetic), hàm lượng formalin và acid acetic có thể thay đổi tùy thuộc vào loại mẫu.

     

     - Dung dịch Bouin được chuẩn bị như sau:

         Dung dịch axit picric bão hòa 750 mL

         Formol 40% 250 mL

         Acid acetic 50 mL

     - Cách chuẩn bị dung dịch formol trung tính:

         Sodium phosphate (NaH2PO4.H2O) 4 g

         Sodium phosphate (Na2HPO4) 6,5 g

       

    Hòa tan trong 750 mL nước cất, thêm vào 100 mL formol (37- 40%); sau đó thêm nước vào cho đủ 1000 mL.